撰文│杏　仁

編輯│李佳潞

審校│湯紅明

來源：東方干細(xì)胞科普團

科普 | 幾種常見干細(xì)胞的制備方法

干細(xì)胞存在于人體的各項組織器官中，骨髓、外周血、胚胎、臍帶、脂肪、乳牙、智齒、尿液等都存在干細(xì)胞，人體中的干細(xì)胞經(jīng)過了一系列的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的制備和質(zhì)檢流程，成為合格的干細(xì)胞制劑，便可應(yīng)用于臨床試驗。

然而，從以上組織器官中將干細(xì)胞“找”出來，可沒那么容易！下面將一一介紹干細(xì)胞家族中的幾位“明星”~

造血干細(xì)胞

Hemopoietic stem cells

造血干細(xì)胞可分為臍帶血造血干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞，其來源分別為臍帶血、骨髓、外周血。

造血干細(xì)胞具有來源豐富、移植技術(shù)相對成熟等優(yōu)點，可用于治療再生障礙性貧血、急性白血病等血液系統(tǒng)疾病。

造血干細(xì)胞的培養(yǎng)通常采用血液分選法。

在無菌狀態(tài)下使用連接管引出臍帶靜脈中的臍帶血，由取血員在24小時運送回臍血庫。相關(guān)人員對制備前的臍帶血細(xì)胞數(shù)進行檢測。在依照GMP標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立的實驗室中，通過封閉狀態(tài)下離心，完成臍帶血造血干細(xì)胞的分離，并對制備后的臍帶血細(xì)胞數(shù)進行檢測。

一般情況下，骨髓中的造血干細(xì)胞較多，外周血中的造血干細(xì)胞數(shù)量極少。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)基本采用外周血采集替代從骨髓中抽取的方式獲得造血干細(xì)胞，其過程如同獻血，極大減輕了供者的痛苦。

采集外周血干細(xì)胞前，需提前5天注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（干細(xì)胞動員劑），刺激骨髓造血干細(xì)胞升高，并釋放到外周血里，再使用血細(xì)胞分離儀器，即可提取出外周血造血干細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

Mesenchymal stem cells

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶，主要分布在華通氏膠和臍帶血管周圍。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有擴增能力強、免疫原性低等優(yōu)點。相關(guān)研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在心力衰竭、糖尿病、急性脊髓損傷、移植物抗宿主病、卵巢早衰、阿爾茲海默癥、帕金森病、新冠病毒感染等疾病的治療中表現(xiàn)出良好的安全性和療效。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)通常采用組織塊貼壁法。

取臍帶前，須經(jīng)產(chǎn)婦同意，在其分娩后，由專業(yè)人員剪斷連接嬰兒端和母親的臍帶，并立刻用臍帶夾夾住，裝入無菌袋中。

將臍帶迅速移入裝有PBS的容器中浸泡清洗2次，洗凈殘留血液。剪掉臍帶夾，將臍靜脈、臍動脈及臍帶包膜去除，剝離華通膠。剪碎華通膠組織，加入培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。組織塊貼壁牢固后，補加培養(yǎng)液10~15ml，3~4天換1次培養(yǎng)液。見大量細(xì)胞貼壁后輕晃培養(yǎng)瓶，使組織塊脫離瓶底，將其接種于新培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)進行貼壁培養(yǎng)。同一臍帶組織塊至少可反復(fù)進行3次重復(fù)貼壁培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞生長情況每隔3~4天換液1次。之后根據(jù)細(xì)胞生長情況進行換液、傳代，即可培養(yǎng)出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

脂肪干細(xì)胞

Adipose-derived stem cells

脂肪干細(xì)胞來源于脂肪組織，主要分布在皮下、內(nèi)臟周圍、肌肉間隙及乳房組織。

脂肪干細(xì)胞具有分布廣泛、儲量豐富等優(yōu)點。相關(guān)研究表明，脂肪干細(xì)胞能夠有效治療骨關(guān)節(jié)炎、心肌梗死、復(fù)雜性肛瘺等疾病。

脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)通常采用酶消化法。

在無菌狀態(tài)下抽取脂肪組織，PBS漂洗后充分剪碎至糊狀，加入Ⅰ型膠原酶，置于搖床中37℃下震蕩30分鐘進行消化。

終止消化后離心，去上清液及未消化的脂肪，少量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸液經(jīng)200目銅網(wǎng)過濾，離心后得到單個核細(xì)胞。經(jīng)過計數(shù)后進行傳代培養(yǎng)，即可得到脂肪干細(xì)胞。

牙髓干細(xì)胞

Dental pulp stem cells

牙髓干細(xì)胞來源于乳牙、智齒、正畸牙，主要分布在牙髓中。

牙髓干細(xì)胞具有具有活性強、無倫理爭議等優(yōu)點。相關(guān)研究表明，牙髓干細(xì)胞可用于治療牙周炎、腦卒中、脊髓損傷等疾病。

牙髓干細(xì)胞通常采用酶消化法。

將脫落或拔除的牙齒置于75%酒精中浸泡30min，PBS清洗牙齒，持骨鉗夾碎牙根，暴露出牙髓。

取出牙髓并置于PBS中，將牙髓組織剪碎，加入Ⅰ型膠原酶后置于搖床中，37℃下震蕩30分鐘，100目濾網(wǎng)過濾，離心后棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度進行進一步培養(yǎng)，即可得到牙髓干細(xì)胞。

尿源性干細(xì)胞

Urine-derived stem cells

尿源性干細(xì)胞來源于腎臟，主要分布于尿液中。

尿源性干細(xì)胞具有無創(chuàng)取材等優(yōu)點。相關(guān)研究表明，尿源性干細(xì)胞可用于治療糖尿病腎病、肝損傷、陰莖勃起功能障礙等疾病。

尿源性干細(xì)胞來源于尿液。具有無創(chuàng)取材等優(yōu)點。

尿源性干細(xì)胞通常采用貼壁篩選法。

取0.1%明膠置于細(xì)胞培養(yǎng)板孔底鋪平，放置37°C培養(yǎng)箱30分鐘以上備用（在明膠不蒸干的情況下可以保存兩周）。制備前提前將包被好的明膠自然風(fēng)干。

無菌取尿瓶表面噴75%酒精消毒，受試者戴無菌手套，進行200ml或以上清潔中段尿收集。75%酒精消毒尿瓶外表面，將尿液放入離心管中離心。棄尿上清，PBS吹打混勻沉淀。離心后棄上清，專用培養(yǎng)基重懸沉渣，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

第8天開始在光鏡下觀察是否有克隆形成，待克隆細(xì)胞融合度達(dá)90%以上后進行消化，通過后續(xù)培養(yǎng)即可獲得尿源性干細(xì)胞。

以上就是幾種干細(xì)胞制劑常見的制備方法。但傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)體系單批次生產(chǎn)細(xì)胞數(shù)量少，難以滿足大量患者需求，且存在培養(yǎng)周期長、污染風(fēng)險高、生產(chǎn)成本大、批間差異大等不足，干細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)迫在眉睫。

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目前，同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細(xì)胞基地GMP實驗室研制的干細(xì)胞3D低氧規(guī)模化生產(chǎn)設(shè)備解決了以上問題，在生產(chǎn)工藝上，其主要有以下幾個創(chuàng)新點：

（1）采用3D低氧的培養(yǎng)條件，有效降低活性氧物質(zhì)（ROS）的積累，減少DNA損傷，提高細(xì)胞活力和細(xì)胞干性；

（2）可進行大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞一批次可獲得上千億級別的數(shù)量，成本比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式降低至少10倍以上；

（3）B+A生產(chǎn)環(huán)境采用隔離器裝置，降低中間過程污染的風(fēng)險；

（4）采用世界上最先進的細(xì)胞成像獲取和數(shù)據(jù)分析軟件，實時監(jiān)控細(xì)胞生長的狀態(tài)。

干細(xì)胞3D低氧規(guī)模化生產(chǎn)設(shè)備擬解決干細(xì)胞數(shù)量級的瓶頸問題，為后續(xù)成藥性、基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究提供良好的平臺和示范點，努力推動干細(xì)胞成藥性的進程。

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